2007-10-03 | 軟瓊脂集落形成率實驗(軟瓊脂克隆)
將1.2％低熔點瓊脂糖與2×細胞培養基以1:1 的體積比混合制備0.6％的底層瓊脂，6 孔板中每個孔1.4ml 溫室凝固，取對數期細胞，胰酶消化后吹散成單個細胞懸液，計數，并調細胞濃度為10000 個/ml，將0.6％低熔點瓊脂糖與2×細胞培養基以1:1 的體積比混合，制備0.3％的上層瓊脂，每孔加1ml 上層瓊脂和100ul 單細胞懸液（約1000cell/well)，混勻，室溫凝固。置于37℃，5％CO2 的
細胞培養箱中培養2－3 周，計數含50 個細胞以上得克隆，計算細胞集落形成率，SpotII 采集圖像。
2007-10-03 | MTT檢測細胞增殖及見解
細胞以每孔3000個接種**96孔板，分成不同組，每組3孔，利用含有10％ 胎牛血清的DMEM培養液培養24 h之后，向培養液中加入一定工作濃度的藥物（單體或混合物），繼續培養24 h或48h。培養結束，直接向每孔加入5mg/ml的MTT 10μl，孵育2－4小時（應常在顯微鏡下觀察）。去除培養液，每孔加入DMSO 100μl，充分振蕩3分鐘，立即在酶標儀上測定490nm的吸光度值。
由于這種方法基于琥珀酸脫氫酶的活性，因而加入MTT之后應該在顯微鏡下觀察，藥物是否可以改變細胞琥珀酸脫氫酶的活性。若是改變則不可以使用此種方法。
另有根據細胞ATP含量測定細胞增殖的方法，但是都要考慮藥物對細胞ATP是否有影響。
所以測定細胞增殖，**簡單，**原始，**麻煩的方法，進行細胞計數我們感覺還是**好的方法。
細胞培養方法
哺乳動物細胞培養規則：
1， 嚴格按照細胞培養室規則進行哺乳動物細胞，由于細胞為整合生物中心共用，使用緊張，在使用時盡可能提高速度，保證操作規范。
2， 使用細胞間之后，主動將安全柜臺面和桌面等清理整齊干凈。
3， 在自己培養細胞出現污染之時，及時通報同一
培養箱培養細胞者，并將培養相關細胞的
培養液/PBS/胰酶等全部清出細胞培養室，以減輕對細胞培養的影響。
4， 實驗所用細胞培養原則要求：A，細胞復蘇之后兩代開始使用；B，保證細胞每次傳代前密度不超過90%；C，細胞使用**多12代（約2個月）。
5， **好每天觀察細胞生長狀態，若有異常及時處理。
6， 具體參照
www.atcc.org中細胞培養要求。
細胞傳代方法
1， 將長**80-90%細胞的培養瓶中原來的培養液棄去。
2， 加入0.5—1ml 0.25％胰酶溶液，使瓶底細胞都浸入溶液中。
3， 瓶口用瓶蓋蓋好，放在倒置鏡下觀察細胞。隨著時間的推移，原貼壁的細胞逐漸趨于圓 形，在還未漂起時將胰酶棄去，加入適當體積的培養液終止消化。觀察消化也可以用肉眼，當見到瓶底發白并出現細針孔空隙時終止消化。一般室溫消化時間約為1—3分鐘。根據不同細胞而異。
4， 用吸管將貼壁的細胞吹打成懸液，盡可能的避免氣泡產生，分到另外兩到三瓶中，置37℃下繼續培養。第二天觀察貼壁生長情況。
5， 細胞培養液參照
www.atcc.org，一般含有10%胎牛或小牛血清。
96/24孔板傳代：
1， 前同于普通細胞傳代方法。
2， 細胞吹打均勻后，對細胞進行計數，根據需要調**適當濃度。例如：每孔傳代10000個細胞，可以將細胞調**濃度十萬，之后利用排槍，吸取100ul，**96孔板中。
3， 24孔板，采用1ml移液器進行傳代。
細胞凍存方法
1， 預先配制凍存液：含90%FBS，10%DMSO的凍存液，DMSO液用培養液配好，避免因臨時配制產熱而傷害細胞；
2， 取對數生長期細胞，經胰酶消化后，加入適量凍存液,用吸管吹打制成細胞懸液（1×10
6 ～ 5 ×10
6細胞/ml)；
3， 加入1ml細胞于凍存管中，密封后標記冷凍細胞名稱/冷凍日期/操作者。
4， 放于程序降溫盒，之后在-80℃冰箱過夜。
5， 將程序降溫盒中細胞放于液氮保存。
6， 要保證凍存細胞數量。
細胞復蘇方法
1， 從液氮中取出冷凍管，迅速投入37～38
℃水浴中，不斷搖動使其融化（1分鐘左右）；
2， 盡快用培養液稀釋**原體積的10倍以上；
3， 低速離心10分鐘，1000轉；
4， 去上清，加新鮮培養液培養剛復蘇的細胞。
5， 盡快對復蘇細胞進行換液。
6， 擴大培養后，再凍存**少復蘇數量的細胞，以保證細胞庫的完整。
細胞計數
1、將血球計數板及蓋片用雙蒸水擦試干凈，并將蓋片蓋在計數板上。
2、將細胞懸液吸出少許，滴加在蓋片邊緣，使懸液充滿蓋片和計數板之間。
3、靜置3分鐘。
4、鏡下觀察，計算計數板四大格細胞總數，壓線細胞只計左側和上方的。然后按下式計算：細胞數/ml＝4大格細胞總數/4×10000
實驗前準備下列物品：雙蒸水 瓶子（500ml、250ml），離心管，tip頭，Eppendorf管，濾紙，餐巾紙，微量加樣器20-50µl。 具體實驗步驟如下：#p#分頁標題#e##p#分頁標題#e#
細胞總蛋白的提取
利用RIPA細胞裂解液，提取經處理細胞的總蛋白，根據RIPA試劑盒提取步驟如下：
1，收集細胞，加入300µlRIPA和3µlPMSF（不可以預先加入PMSF），利用槍頭吹打，放置于冰上30min
2，將樣品于4℃、30min、20000g離心
3，小心將上清液轉移到新的離心管中，分裝成每管25µl，于－70℃保存
4，兩份5µl的細胞裂解液，稀釋10倍之后，利用BCA法測定蛋白質濃度。
利用BCA－100蛋白質定量測定試劑盒（購自上海申能博采生物科技有限公司）測定蛋白質濃度，步驟如下
1，SolutionA and SolutionB混合液（根據需要確定混和量，A：B＝50：1）
A，繪制標準曲線和加樣，如下表3－4：
|
|
1 |
4 |
5 |
7 |
|
BSA（μl） |
0 |
1.25 |
2.5 |
5 |
|
A＋B（μl） |
100 |
98.75 |
97.5 |
95 |
|
OD570 |
0.005 |
0.063 |
0.123 |
0.243 |
|
OD570 |
0.003 |
0.067 |
0.128 |
0.245 |
|
OD570 |
0.006 |
0.065 |
0.120 |
0.248 |
|
OD570（平均值） |
0.0046 |
0.065 |
0.1233 |
0.245 |
|
濃度（μg/ml） |
0 |
100 |
250 |
500 |
B, 將上述加好的樣品放于酶標板
C，將酶標板放于37℃搖床放置30min
D，取出酶標板，利用酶標儀測定其OD570
E，繪制標準曲線，如圖：3－1
E，根據標準曲線測定樣品的濃度。
F，稀釋之后樣品濃度測定值如下表3－5：
|
NaF濃度 |
0 |
4mM |
6mM |
8mM |
|
樣品量（μl） |
5 |
5 |
5 |
5 |
|
A＋B（μl） |
95 |
95 |
95 |
95 |
|
OD570 |
0.095 |
0.090 |
0.099 |
0.080 |
|
OD570 |
0.090 |
0.086 |
0.096 |
0.086 |
|
OD570 |
0.098 |
0.089 |
0.098 |
0.085 |
|
OD570（平均值） |
0.094 |
0.088 |
0.098 |
0.084 |
|
濃度（μg/ml） |
179.7 |
167.0 |
188.2 |
158.6 |
配制SDS－PAGE膠
將垂直電泳用玻璃，先用自來水沖洗多次，之后利用蒸餾水沖洗干凈，放置于烘箱中烤干，將玻璃放置在制膠架上，根據上述PAGE膠的配置方法配制分離膠，之后將配制膠灌于兩個玻璃之間**距梳齒0.5cm或距玻板1.5cm處標記(膠會收縮)。 加入一層異丁醇厚約1cm，置30-45min,兩者之間會出現一條明顯的界線，量分離膠的寬度，倒出，沖洗（1×Tris/SDS，PH8.8）未聚合的丙烯酰胺，濾紙（普通）吸干（帶手套，Whatman3mm濾紙）。
加入積層膠，插梳子，置30-45min，拔梳子，沖洗（蒸餾水）未聚合的丙烯酰胺，把凝膠固定于電泳裝置，加入1×電泳緩沖液，排出凝膠底部兩玻板間的氣泡（注射器彎90℃），不要預電泳，以免破壞緩沖系統的不連續性。#p#分頁標題#e##p#分頁標題#e#
加樣（冰上）
加樣緩沖液用前加50µl β-巰基乙醇**950µl sample buffer（5µl-95µl，10µl-190µl，15µl-285µl，20µl-380µl），sample buffer稀釋樣品（100µg總蛋白，**少30µg）**少1：2，總體積<25µl（30-45µl），約20µl（可用水試驗一下），100℃ 5min,沖洗加樣孔，加樣，注意加樣均勻，水沖洗槍頭于餐巾紙。**外側加等量樣品緩沖液，避免邊緣效應，或MARK（預染蛋白質marker）加樣孔。
電泳和取膠
正負極正確連接，80v，90-120min(1h)，電泳**溴酚藍到達凝膠底部為止；關閉電源，帶手套（防止油脂阻礙蛋白轉膜）將膠取出放于一吸水紙上，備盒子，轉移液多一點，撬玻璃，浸濕一下，刮下**左邊的兩個加樣齒做標記，玻璃作尺子，切積層膠，墊片挑下，轉移緩沖液，搖30min。
電轉（帶手套，油脂阻礙蛋白轉膜）
利用電轉緩沖液浸泡濾紙15min，并利用甲醛浸泡PVDF膜5min，再用電轉緩沖液浸泡PVDF膜10min，之后按照大濾紙-膜-膠-紙(試管趕氣泡)放置于電轉設置，于冰中電轉，350mA，120min，看電流，取膜，切硝酸纖維膜的右上角標記（參考分子克隆紅皮P366）
此步之后可以利用麗春紅染液檢測轉膜效果，并記錄蛋白Marker的位置，確定電轉效果。然后再利用蒸餾水洗滌多次，可以將麗春紅染液洗掉，繼續進行下面實驗。
封閉
將膜浸于封閉液（含有5％脫脂奶粉，0.1％（v/v）的PBS－T或者TBS－T）中，在水平脫色搖床上，室溫2.5h。之后快速利用wash buffer洗滌一次15min,再洗兩次各5min。
加入一抗
shou先按要求將一抗利用PBS－T或TBS－T稀釋，將PVDF膜放于雜交袋中，按0.1ml/cm
2比例加入一抗稀釋液，放于4℃冰箱過夜；之后浸于Wash buffer，按照>4ml/cm
2室溫洗滌一次15min，之后利用新鮮的Wash buffer2×5min洗滌。
加入二抗
將二抗按照要求進行稀釋于PBS－T或TBS－T中，室溫將膜浸于二抗，放于脫色搖床2.5h，之后和步驟8一樣洗滌。
染色
將kit中的solution1和solution2等體積混和，之后按照0.125/cm
2等體積覆蓋于膜上（蛋白面向上，膜放于平面上），室溫放置1min，將膜利用鑷子趕走多余的detecton reagent
顯影
將膜蛋白面向上，放于X－ray Film cassette,在暗室中將film放于膜上，蓋上cassette，5分鐘。快速沖洗,之后放于第二個film，放置10min.將沖洗的膠片放于室溫涼干。
2007-09-29 | 定量PCR技術思考
定量PCR現在已經是一種常規的生物學實驗技術手段，俺也有相當一段時間采用這種技術來分析基因的表達。現將此技術與大家分享。
其實我認為定量PCR**常用的是相對定量，其實和我們以前的半定量PCR一樣，只是此技術的升級版本。定量PCR**大的麻煩是特異性和污染問題。
特異性主要當然是引物的設計，所以我主張：
shou先采用別人發表的引物為佳。當然采用的paper的級別要高點為好，例如PNAS以上等，這樣的可信度高。
其次就是自己設計，設計的原則在takara的定量PCR宣傳冊已經非常的詳細，但是一般來說很難能夠達到完全符合要求。這樣**好設計兩對以上的引物，進行定量PCR。定量PCR是要看溶解曲線的，而且要關心溶解曲線峰的寬度，但是這個不是很準確，從嚴格的角度來說，還要在定量PCR之后，將產物進行電泳檢測，看是否特異。若是特異才可以采用這種方法。
再次，內參我認為**少應該采用兩個，因為現在發現很多的藥物等可以改變beta－actin的表達。
**后，做此實驗時，一定要獨立重復，而不是復孔進行實驗。
此實驗一定要嚴格帶手套進行，以防污染，一旦污染整個實驗便沒有意義，即使只是一點點污染。
軟瓊脂克隆法與裸鼠體內接種法檢測細胞致瘤性的比較
