細胞培養(yǎng)發(fā)展史及其應(yīng)用
 
（一）前言
 
20世紀初，人們不知道神經(jīng)纖維是由神經(jīng)細胞的細胞質(zhì)向外突出形成的，還是由神經(jīng)細胞周圍的其他細胞融合而成的。生物學家們就這個問題展開了激烈的爭論。1907年，美G生物學家哈里森(Harrison)從蝌蚪的脊索中分離出神經(jīng)組織，把它放在青蛙的凝固的淋巴液中培養(yǎng)。蝌蚪的神經(jīng)組織存活了好幾周，并且從神經(jīng)細胞中長出了神經(jīng)纖維。哈里森的實驗不僅解決了神經(jīng)纖維的起源問題，而且開創(chuàng)了動物組織培養(yǎng)的先河。此后，在許多科學家的不懈努力下，動物組織培養(yǎng)不斷改進并逐漸發(fā)展成為動物細胞培養(yǎng)。
所謂動物細胞培養(yǎng)(亦稱組織培養(yǎng))既有別于植物細胞培養(yǎng)，又與微生物的培養(yǎng)完全不同。所謂動物細胞培養(yǎng)是指離散的動物活細胞在體外人工條件下的生長、增殖過程，在此過程中細胞不再形成組織。
由于動物細胞培養(yǎng)是在人工條件下進行的，便于調(diào)控和觀察，因而成為現(xiàn)今研究動物的物質(zhì)代謝過程、染色體的形態(tài)變化、以及遺傳物質(zhì)的表達調(diào)控等高難*域的既便利而又有效的新方法。同時，隨著現(xiàn)代生物化學、分子生物學、分子遺傳學、以及現(xiàn)代醫(yī)學的發(fā)展，細胞培養(yǎng)也在許多應(yīng)用*域充分展示了其巨大的發(fā)展?jié)摿Γ⒁褳槭廊怂P(guān)注。盡管如此，動物細胞培養(yǎng)仍是一門年輕的新學科，在發(fā)展之初被混淆于動物組織培養(yǎng)之中。
 
（二）細胞培養(yǎng)技術(shù)及其歷史
 
細胞培養(yǎng)的歷史**早可追溯到19 世紀末，據(jù)可考證的資料記載Wilhelm Roux是**個進行動物組織培養(yǎng)實驗的人。
1885年Wilhelm Roux 將雞胚髓板放置于溫熱鹽水中使之維持存活了數(shù)天，是有記錄的**個體外移植成功的例子。
1887年Arnold把愷木的木髓碎片接種到蛙的身上。當白細胞侵入這些木髓碎片后，他把這些白細胞收集在盛將鹽水的小碟中，接下來觀察到這些白細胞在運動，并存活了一個短的時間。
    1903年，Jolly將蠑螈的白細胞保存在懸滴并維持了十個月。
    1906年，Beebe和Ewing在動物的血液中嘗試培養(yǎng)了傳染性巴肉瘤的細胞。
可是，由于當時的培養(yǎng)基并不理想，因此實驗難以重復，并且也難以證明這些先軀者所培養(yǎng)的是否是真正存活的健康的組織和細胞。結(jié)果都和Welhelm ，一樣只能維持離體細胞的短期存活,而沒有細胞的生長和增殖。
直到1907年，美G胚胎學家Ross Harrison的實驗才被公認為組織培養(yǎng)真正開始的標志，因為該實驗但提供了可重復的技術(shù)，而且證明了生物組織的功能可以在體外十分明確地延續(xù)下去。Ross Harrison將蛙胚神經(jīng)管區(qū)的一片組織移植到蛙的淋巴液凝塊中，這片組織在體外不但存活了若干星期，而且居然還從細胞中長出了軸突(神經(jīng)纖維)， 解決了當時關(guān)于軸突起源的爭論，并表明了利用體外存活的組織進行實驗研究的可能性。他所采用的把培養(yǎng)物放在蓋玻分上并倒置于凹玻片腔中的方法還一直沿用**今，稱為蓋片復蓋凹窩玻璃懸滴培養(yǎng)法 。
在此基礎(chǔ)上，1912年Carrel 則更加豐富和完善了此項技術(shù)，他將無菌操作技術(shù)引入動物細胞培養(yǎng)，在沒有使用抗菌素的條件下使雞胚心臟細胞在人工培養(yǎng)條件下生存了34年，并且先后傳代3400次。并發(fā)現(xiàn)動物體液中存在著對動物細胞生長有強烈促進作用的生長因子。這一結(jié)論早已被現(xiàn)在的研究所證實，并成為無血清培養(yǎng)基研究的基礎(chǔ)。由于這兩個人的**成就，細胞培養(yǎng)從此開始了迅猛的發(fā)展，并成為生物工程特別是細胞工程中一項重要的基礎(chǔ)技術(shù).
1912年，當時的Carrel是外科醫(yī)生，在實驗中特別注意無菌操作。他用血漿包埋組織塊外加胎汁的培養(yǎng)法，并采用了更新培養(yǎng)基和分離組織的傳代措施，從而完善了經(jīng)典的懸滴培養(yǎng)法（Suspension Culture）。Carrel用這種方法，曾培養(yǎng)一雞胚心肌組織長達數(shù)年之久。這些創(chuàng)造性的工作充分揭示：離體的動物組織在培養(yǎng)條件下，具有近于無限的生長和繁殖能力；并充分證明組織培養(yǎng)的確是研究活組織和細胞的極好方法。
1924年Maximow又把Carrel的懸滴培養(yǎng)法改良為雙蓋片培養(yǎng)，使之更易于傳代和減少污染。Carrel又設(shè)計了用卡氏瓶培養(yǎng)法，擴大了組織的生存空間。自懸滴培養(yǎng)問世后的30年中，以Harrlson和Carrel為shou的科學家們，用這些方法對各種組織在體外生長的規(guī)律和細胞形態(tài)進行了深入的研究，發(fā)表了大量論文，為組織培養(yǎng)的進一步發(fā)展奠定了鞏固的基礎(chǔ)。
 
（三）動物細胞的培養(yǎng)方法
 
（1）貼壁培養(yǎng)法
大多數(shù)動物細胞在離體培養(yǎng)條件下都需要附著在帶有適量正電荷的固體或半固體的表面上才能正常生長，并**終在附著表面擴展成單層。其基本操作過程是：先將采集到的活體動物組織在無菌條件下采用物理(機械分散法) 或化學(酶消化法) 的方法分散成細胞懸液，經(jīng)過濾、離心、純化、漂洗后接種到加有適宜培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿(瓶、板) 中，再放入二氧化碳培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)。用此法培養(yǎng)的細胞生長良好且易于觀察，適于實驗室研究。但貼壁生長的細胞有接觸抑制的特性，一旦細胞形成單層,生長就會受到抑制，細胞產(chǎn)量有限。如要繼續(xù)培養(yǎng)還需將已形成單層的細胞再分散，稀釋后重新接種，然后進行傳代培養(yǎng)。
（2）懸浮培養(yǎng)#p#分頁標題#e##p#分頁標題#e#
少數(shù)動物細胞屬于懸浮生長型，這些細胞在離體培養(yǎng)時不需要附著物，懸浮于培養(yǎng)液中即可良好生長，如淋巴細胞和腫瘤細胞。懸浮生長的細胞其培養(yǎng)和傳代都十分簡便。培養(yǎng)時只需將采集到的活體動物組織經(jīng)分散、過濾、純化、漂洗后，按一定密度接種于適宜培養(yǎng)液中，置于特定的培養(yǎng)條件下即可良好生長。傳代時不需要再分散，只需按比例稀釋后即可繼續(xù)培養(yǎng)。此法細胞增殖快、產(chǎn)量高、培養(yǎng)過程簡單，是大規(guī)模培養(yǎng)動物細胞的理想模式。但在動物體中只有少數(shù)種類的細胞適于懸浮培養(yǎng)。
③ 大規(guī)模培養(yǎng)法
動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)是在貼壁培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)的基礎(chǔ)上融合了固定化細胞、流式細胞術(shù)、填充床、生物反應(yīng)罐技術(shù)以及人工灌流和溫和攪拌系統(tǒng)等技術(shù)后發(fā)展起來的。始于20 世紀60 年代初Capstick 及其同事為生產(chǎn)FMD 疫苗而對BHK 細胞的研究。其后，隨著生物技術(shù)產(chǎn)品倍受世人親睞，動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)也隨之得到了迅猛發(fā)展，并形成了幾種比較成熟且有應(yīng)用價值的大規(guī)模培養(yǎng)方法。
① 空心纖維法：空心纖維培養(yǎng)法是Richard kncazek 等在1972 年創(chuàng)建的。**初使用的空心纖維是一種由醋酸纖維素和硝酸纖維素混合組成的可透性濾膜，外徑約為1/3～3/4mm ，表面具有海綿狀多孔結(jié)構(gòu)，既能使水分子、營養(yǎng)物質(zhì)和氣體透過，也能使細胞在上面貼附生長。這種培養(yǎng)系統(tǒng)的核心部分是由3～6層這樣的空心纖維組成的，培養(yǎng)時將待培養(yǎng)細胞接種于空心纖維的外腔，培養(yǎng)一段時間后，當細胞密度達到107-107個/ml時逐漸用無血清培養(yǎng)液代替含血清培養(yǎng)液。此時細胞雖不再增殖，但能正常生活并繼續(xù)分泌所需的蛋白質(zhì)或其他生物制品。由于這種培養(yǎng)方法在分離和純化分泌物時很方便，因而在生產(chǎn)激素和單抗時被廣泛應(yīng)用。并相繼開發(fā)出了由硅膠、聚砜、聚丙烯等材料構(gòu)建的新的空心纖維培養(yǎng)系統(tǒng)。
② 微載體法：微栽體法是Wezel 在1967 年shou先創(chuàng)建的。所采用的微栽體是由天然葡聚糖聚合物或其他聚合物制成的固體小珠，其直徑約在50 微米到數(shù)百微米之間。培養(yǎng)動物細胞時先將微載體在血清中浸泡一下(可加快細胞與微載體的貼附速度) ，然后將制備好的細胞懸液和微載體混合孵育一段時間，待細胞貼附于微載體上后再轉(zhuǎn)移**培養(yǎng)液中培養(yǎng)，并借助溫和攪拌系統(tǒng)使細胞隨載體均勻懸浮于培養(yǎng)液中。這樣細胞就能夠在微載體表面迅速生長、增殖，細胞濃度可高達107個/ml 。微載體法是一種完全將貼壁培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)融為一體的培養(yǎng)方法。因而不但能使細胞均勻分布，提高了對培養(yǎng)液和培養(yǎng)空間的利用，而且適于各種細胞的大規(guī)模培養(yǎng)，收獲過程簡單，放大生產(chǎn)也很容易。因而是一種比較理想的大規(guī)模培養(yǎng)方法。只是此法對微載體的要求較高。
③ 微囊法: 微囊法是美GDamon Biotech 公司創(chuàng)建的一種比較理想的大規(guī)模動物細胞培養(yǎng)法。其基本技術(shù)是：先將欲培養(yǎng)的動物細胞懸浮于海藻酸鈉溶液中，之后使其通過一種成滴裝置(微囊發(fā)生器) 而逐滴滴入CaCl2 溶液中，海藻酸鈉一旦進入CaCl2 溶液后即形成半透膜微囊，從而將細胞封閉在其內(nèi)。然后再將這種包含有細胞的微囊懸浮于培養(yǎng)液中培養(yǎng)。這樣培養(yǎng)液中的水和營養(yǎng)物質(zhì)可透過半透膜進入微囊供應(yīng)給細胞,細胞的代謝物也可透過半透膜被排出,而細胞分泌的大分子物質(zhì)則被阻留而積累與囊內(nèi)。當培養(yǎng)一段時間后，在細胞密度達到107/ml時即可分離收集微囊，**后破開微囊就能獲得高度純化的大分子產(chǎn)物。
細胞培養(yǎng)工作中，以下幾個方面來預(yù)防支原體的污染：
①控制環(huán)境污染；
②嚴格實驗操作；
③細胞培養(yǎng)基和器材要保證無菌；
④在細胞培養(yǎng)基中加入適量的抗生素。
清除支原體，常用方法有：抗生素處理、抗血清處理、抗生素加抗血清和補體聯(lián)合處理。支原體**有抑制活性及常用于支原體感染治療的抗生素是四環(huán)素類、大環(huán)內(nèi)酯類及一些氟喹諾酮；其他類抗生素如氨基糖苷類、氯霉素對支原體有較小抑制作用，所以常不用來作為支原體感染的化學治療劑。InvivoGen公司研究開發(fā)的新一代支原體抗生素M-Plasmocin能有效地殺滅支原體，不影響細胞本身的代謝，并且用M-Plasmocin處理過的培養(yǎng)細胞，不會重新感染支原體。
 
（四）應(yīng) 用
 
（1）在生物學基礎(chǔ)研究中的應(yīng)用
離體培養(yǎng)的動物細胞具有培養(yǎng)條件可人為控制且便于觀察檢測的特點，因而可廣泛應(yīng)用于生物學*域的基礎(chǔ)研究中。在細胞生物學上，動物細胞培養(yǎng)可用于研究動物的正常或病理細胞的形態(tài)、生長發(fā)育、細胞營養(yǎng)、代謝以及病變等微觀過程。如神經(jīng)細胞的增殖、突起生長、相互識別、刺激傳遞等機理就是通過進行各種神經(jīng)細胞的培養(yǎng)才弄清楚的。在遺傳學研究中，除可用培養(yǎng)的動物細胞進行染色體分析外，還可結(jié)合細胞融合技術(shù)建立細胞遺傳學進行遺傳分析和雜交育種；在胚胎工程中通過體外培養(yǎng)卵母細胞并進行體外受精、胚胎分割和移植已發(fā)展成了一種較成熟的技術(shù)而應(yīng)用于家畜的繁殖生產(chǎn)中。另外，分離和培養(yǎng)具有多潛能性的胚胎干細胞，還可用于動物克隆、細胞誘導分化、動物育種的研究，并可作為基因轉(zhuǎn)移的高效表達載體；在病毒學研究中用培養(yǎng)的動物細胞代替試驗動物做斑點分析，不僅方法簡便、準確、而且重復性好。#p#分頁標題#e##p#分頁標題#e#
（2）在臨床醫(yī)學上的應(yīng)用
shou先，動物細胞培養(yǎng)技術(shù)可用于遺傳疾病和先天畸型的產(chǎn)前診斷。目前，人們已經(jīng)能夠用羊膜穿刺技術(shù)獲得脫落于羊水中的胎兒細胞經(jīng)培養(yǎng)后進行染色體分析或甲胎蛋白檢測即可診斷出胎兒是否患有遺傳性疾病或先天畸型，以此可避免先天殘疾兒的誕生。現(xiàn)在用這種方法已能檢測出幾十種代謝性遺傳缺陷疾病和先天畸型疾病。其次，現(xiàn)在的一些科學研究已能通過染色體對比分析檢測出易患癌癥的病人，以便進行及早的預(yù)防和治療。在這方面我G的科學工作者有較突出的研究成果：他們改進了淋巴細胞的培養(yǎng)方法，從而使帶有癌基因的人的染色體表現(xiàn)出明顯高于常人的畸變率，這就從細胞分子水平揭示了癌癥的病理、病因，并為癌癥的早期診斷和預(yù)防提供了科學依據(jù)。再次，細胞培養(yǎng)還可用于臨床治療。目前已有將正常骨髓細胞經(jīng)大量培養(yǎng)后植入患造血障礙癥患者體內(nèi)進行治療的報道。另外，動物細胞培養(yǎng)生產(chǎn)的生物大分子制品也可用于治療某些代謝缺陷疾病。
（3）在動物育種上的應(yīng)用
目前，由于細胞培養(yǎng)技術(shù)、細胞融合技術(shù)、細胞雜交技術(shù)以及轉(zhuǎn)基因技術(shù)的創(chuàng)建與相互結(jié)合，使得人們能夠在細胞水平操作并改變動物的基因進行遺傳物質(zhì)的重組。這樣就可以按照人類的需要大幅度地改變生物的遺傳組成，從而使新品種的培育在實驗室中即可完成，可大大縮短育種進程，且使育種工作更加經(jīng)濟有效。胚胎干細胞的研究成果和克隆羊多莉的問世可以說已為動物遺傳育種開辟了一條新途徑。
（4）可用于生產(chǎn)大分子生物制品
利用動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)生產(chǎn)大分子生物制品始于上世紀60 年代,當時是為了滿足生產(chǎn)FMD 疫苗的需要。后來隨著大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)的逐漸成熟和轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用,人們發(fā)現(xiàn)利用動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)來生產(chǎn)大分子藥用蛋白比原核細胞表達系統(tǒng)更有優(yōu)越性。隨著大量**性細胞株的創(chuàng)建,在商業(yè)利益的刺激下,動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)也迅速發(fā)展起來,并被付之于應(yīng)用。目前，用動物細胞可生產(chǎn)的生物制品有各類疫苗、干擾素、激素、酶、生長因子、病毒殺蟲劑、單克隆抗體等，其銷售收入已占到世界生物技術(shù)產(chǎn)品的一半以上。我們相信，隨著動物細胞培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展，以后還會有更多的生物制品被開發(fā)并用于造福人類。
 
 
 
 
 
動物細胞培養(yǎng)基的發(fā)展及應(yīng)用
 
（一） 引言
 
近年來，動物細胞培養(yǎng)技術(shù)已從單純的實驗操作擴展到生物學研究和商業(yè)利用的許多方面，成為廣泛采用的技術(shù)手段。許多生物技術(shù)科學研究和產(chǎn)品的生產(chǎn)都離不開細胞培養(yǎng)。在細胞培養(yǎng)發(fā)展史中，細胞培養(yǎng)
基的發(fā)展占有很重要的位置。動物細胞培養(yǎng)基是體外細胞培養(yǎng)的重要因素。根據(jù)培養(yǎng)基的來源及成分的明確程度，動物細胞培養(yǎng)基的發(fā)展大致可分為3個階段：天然培養(yǎng)基階段、合成培養(yǎng)基階段、無血清培養(yǎng)基階段。
 
（二）動物細胞培養(yǎng)基發(fā)展及其應(yīng)用
 
（1） 天然培養(yǎng)基階段 
這一階段是動物細胞培養(yǎng)基的**初及摸索階段。此階段早期機械模擬細胞的體內(nèi)生存環(huán)境，直接采用某些組織凝塊，生物性液體和組織提取液等作為組織細胞的培養(yǎng)基為特征。如血漿凝塊、血清、淋巴液、胚胎浸液等。據(jù)記載，**早進行組織培養(yǎng)的是Roux采用溫生理鹽水培育雞胚組織，使之存活了數(shù)月之久。隨之，美G生物學家Harrison在無菌條件下，以淋巴液為培養(yǎng)基成功的在試管中培養(yǎng)了蛙胚神經(jīng)組織達數(shù)周，創(chuàng)立體外培養(yǎng)方法。后期便開始了對維持細胞生長的營養(yǎng)成分的研究，并為合成培養(yǎng)基階段的到來打下了基礎(chǔ)。但當時由于條件所限始終沒有穩(wěn)定的發(fā)展起來。
（2） 合成培養(yǎng)基階段
合成培養(yǎng)基是根據(jù)已知細胞所需物質(zhì)的種類和數(shù)量嚴格配制而成的。研究表明合成培養(yǎng)基由于成分清楚，故可通過改變或調(diào)節(jié)各種成分的種類、數(shù)量和比例，觀察細胞生物特有的反應(yīng)性變化，測知細胞與外界環(huán)境的關(guān)系，了解細胞生存條件并可誘導細胞定向分化等。自從發(fā)現(xiàn)雞胚組織能在輔加各種氨基酸和多肽Locke溶液中存活一段時間，在含有葡萄糖和麥芽糖的培養(yǎng)液中能存活持久些以來，在隨后時間里人們設(shè)計了許多添加各種輔助成分的培養(yǎng)基。常用合成培養(yǎng)基的種類和特點一般是依據(jù)條件、經(jīng)驗和培養(yǎng)基的特點選用。目前常用的是MEMEagle、RPMI1640培養(yǎng)液等。jue大多數(shù)細胞的體外培養(yǎng)需要在合成培養(yǎng)基中補充一定量的成分不明確的生物性液體或組織提取液才能支持細胞的生長增殖，其中血清因來源豐富且易于保存而成為被**廣泛采用的培養(yǎng)基添加物，**常用的為小牛血清。小牛血清是由很多大小不同生物分子組成的極為復雜的混合物，對促進細胞生長與抑制生長活性是生理平衡的，它不是一種簡單的液體，它含有各種血漿蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物、無機物質(zhì)等。血清的營養(yǎng)作用是極大的補充營養(yǎng)液配方的成分，但是血清中所含的成分復雜。就蛋白質(zhì)而言，血清中所含的蛋白成分不少于150種。這就給動物細胞培養(yǎng)造成了諸多不利的因素：①血清非常昂貴，血清的費用占到培養(yǎng)基費用的50％，致使生產(chǎn)成本大幅度提高。② 血清中含有某些不利于細胞生長的毒性物質(zhì)或抑制物質(zhì)，對某些細胞的體外培養(yǎng)有去分化作用。③血清中大量成分復雜的蛋白質(zhì)給疫苗、細胞因子、單克隆抗體等下游培養(yǎng)產(chǎn)物的分離純化帶來很大的困難。④ 批次與批次之間血清質(zhì)量的差異會影響細胞生長，**終影響產(chǎn)品質(zhì)量。血清易被支原體和雜質(zhì)污染。也正是由于血清的應(yīng)用存在上述問題才促使人們對無血清培養(yǎng)基的研究和應(yīng)用日益重視。為了多種理由除去血清中的不確定成分，創(chuàng)造一種完全化學成分明確的培養(yǎng)液將是一個具有巨大進展意義的工作。#p#分頁標題#e##p#分頁標題#e#
（3） 無血清培養(yǎng)基階段 
無血清培養(yǎng)基就是在合成培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，引入成分完全明確的或部分明確的血清替代成分，使培養(yǎng)基能滿足動物細胞培養(yǎng)的要求，又可有效的克服因使用血清所引發(fā)的問題。由于無血清培養(yǎng)基可以是完全采用已知分子結(jié)構(gòu)和構(gòu)型組分的低蛋白或無蛋白培養(yǎng)基，因而它不僅為研究和闡明細胞生長、增殖和分化的調(diào)節(jié)機制提供了有力的工具，而且為現(xiàn)代生物技術(shù)尤其是細胞工程的應(yīng)用準備了更好的條件。1975年，Hayashi等在培養(yǎng)基中用激素代替血清使垂體細胞株Gh3在無血清介質(zhì)中生長獲得成功，預(yù)示著無血清培養(yǎng)基的誘人前景。進入2O世紀80年代后，新的無血清培養(yǎng)基不斷問世，人們經(jīng)過研究發(fā)現(xiàn)，只要在培養(yǎng)基中增加某些適于細胞生長的成分，如纖連蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、胰島素和表皮生長因子等 砌，不少細胞即能在無血清供應(yīng)的情況下生長口”。尤其是CHO、雜交瘤、骨髓瘤細胞以及BHK細胞等f 51。某些細胞在無血清的條件下，其生長和抗體的產(chǎn)量甚**較有血清培養(yǎng)時高出數(shù)倍。另外，動物細胞培養(yǎng)應(yīng)用無血清培養(yǎng)基的成功，還將為某些疫苗的生產(chǎn)降低成本。這些都足以說明動物細胞無血清培養(yǎng)基的研究和應(yīng)用進入了新的時期。
無血清培養(yǎng)基的優(yōu)勢：
采用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)動物細胞大致有如下好處：①可避免血清批次間的質(zhì)量變動，提高細胞培養(yǎng)和試驗結(jié)果的重復性；②避免血清對細胞的毒性作用和血清源性污染；③避免血清組分對試驗研究的影響；④有利于體外培養(yǎng)細胞的分化；⑤ 可提高產(chǎn)品的表達水平并使細胞產(chǎn)品易于純化。
雖然有上述這些好處存在，但無血清培養(yǎng)基也并非**無缺。其不足之處主要表現(xiàn)為細胞的適用譜極窄，細胞在無血清培養(yǎng)基中更易受某些機械因素和化學因素的影響以及培養(yǎng)基難以保存等，皆不如傳統(tǒng)的添加小牛血清。
無血清培養(yǎng)基的分代：
目前，無血清培養(yǎng)基已進入第3代，第l代無血清培養(yǎng)基雖然不合血清，但含有大量的動物和植物蛋白如牛血清白蛋白BSA和動物的刺激激素等，雖然其總蛋白量明顯低于有血清培養(yǎng)基，但蛋白含量依然很高。因此廠商致力于發(fā)展第2代無血清培養(yǎng)基，其主要特點是完全不用動物來源蛋白，稱之為無血清，無動物衍生蛋白。它的優(yōu)點是既可降低生產(chǎn)成本，又能加快報批的速度， 因為政府藥品監(jiān)管部門對產(chǎn)品是否用含無血清培養(yǎng)基生產(chǎn)相當關(guān)注。由于生物工程的要求，第3代無血清培養(yǎng)基近年已出現(xiàn)，即完全沒有蛋白或含量極低，稱之為雙無培養(yǎng)基，即Serum—free，Protein—free培養(yǎng)基。這帶來下述幾個方面的好處：shou先是因為培養(yǎng)基全為化學已知物，因此細胞培養(yǎng)與生產(chǎn)很容易做到恒定；其次是細胞分泌的目標蛋白的分離純化更為容易；**后是細胞培養(yǎng)基的成本(指原材料成本，不包括研究開發(fā)費用)大為下降，生產(chǎn)中品質(zhì)管理更加容易。早期的無血清培養(yǎng)基其兩個主要指標即細胞生長速率和細胞密度都低于有血清培養(yǎng)基，現(xiàn)在的無血清培養(yǎng)基在上述兩個指標包括蛋白分泌量都不亞于血清培養(yǎng)基，甚**更好。目前預(yù)測第4代無血清培養(yǎng)基將會進入研究與開發(fā)，這將是一種無血清、無蛋白、又可以高溫消毒的適合于許多種不同細胞生長的全能型培養(yǎng)基。
無血清培養(yǎng)基的應(yīng)用:
近年的實踐證明，使用無血清培養(yǎng)基在細胞的生長速率和細胞密度及蛋白的表達水平都不亞于血清培養(yǎng)，甚**在某些方面超過血清培養(yǎng)，而這正是評價細胞培養(yǎng)基的幾個重要指標。無血清培養(yǎng)基尚存在不足的方面，但其顯著的優(yōu)勢將使無血清培養(yǎng)技術(shù)逐步取代含血清細胞培養(yǎng)。無血清培養(yǎng)基已廣泛的應(yīng)用于細胞生物學、藥理學、腫瘤學和細胞工程*域。無血清培養(yǎng)基的應(yīng)用主要表現(xiàn)在以下幾個方面：①研究細胞的分化條件：目前已有許多在含血清的培養(yǎng)基中不能保持原代細胞分化現(xiàn)象的細胞系，在無血清培養(yǎng)基中成功地保留著分化能力和分化現(xiàn)象。如人結(jié)腸癌細胞LIMI1863在無血清培養(yǎng)基的培養(yǎng)下保持著腎臟的轉(zhuǎn)運功能；②用于激素、生長因子和藥物等與細胞相互作用的研究；③用于從多種細胞混雜的培養(yǎng)中選擇目的細胞，通過對無血清培養(yǎng)基中的某些成分的取舍，可抑制原代組織培養(yǎng)物中非目的細胞的過度生長，達到選擇目的細胞的目的；④ 腫瘤病理學和病因?qū)W的研究：如用于研究致癌因子對細胞的影響，研究腫瘤細胞對可能觸發(fā)正常細胞終末分化的外周信號的反應(yīng)能力，或用于研究正常細胞與腫瘤細胞的生長和移行與基底膜信號的關(guān)系等；⑤用于生產(chǎn)疫苗、單克隆抗體和生物活性蛋白等生物制品。這可以說是無血清培養(yǎng)基**重要的同時也是**有發(fā)展前景的應(yīng)用*域。一方面是由于無血清培養(yǎng)基的成分明確、質(zhì)量一致、蛋白含量低，因而有利于提高細胞產(chǎn)品生產(chǎn)的穩(wěn)定性并使細胞產(chǎn)品易于純化；另一方面是可通過對培養(yǎng)基成分的優(yōu)化，使不同的細胞能各自在**有利其生長或**有利于表達目的產(chǎn)物的環(huán)境中持續(xù)高密度培養(yǎng)。
 
(三)展望
 
經(jīng)過幾十年來的研究與實踐應(yīng)用，大規(guī)模動物細胞培養(yǎng)技術(shù)已日趨完善。隨著這一技術(shù)的進一步發(fā)展，人們還將不斷努力設(shè)計理想的生物反應(yīng)器以獲得高密度、高活力的細胞開發(fā)新的無血清培養(yǎng)基，使生物制品更安全，建立細胞培養(yǎng)與產(chǎn)物分離的耦合系統(tǒng)，充分利用培養(yǎng)液以降低生產(chǎn)成本等，動物細胞培養(yǎng)技術(shù)將在生物制備和基因工程等*域得到更廣泛的應(yīng)用圈。#p#分頁標題#e##p#分頁標題#e#
尤其是無血清培養(yǎng)基的發(fā)展更為迅速。無血清培養(yǎng)基具有許多傳統(tǒng)的含血清培養(yǎng)基無法比擬的優(yōu)勢，但還有許多不足之處有待改善。shou先，無血清培養(yǎng)基只能用于一種或少數(shù)幾種細胞高密度生長或高水平表達目的產(chǎn)物，缺少通用性，有待于研究具有廣泛適應(yīng)性的無血清培養(yǎng)基。其次，將無血清培養(yǎng)基與發(fā)酵罐培養(yǎng)技術(shù)相結(jié)合成為一個新的研究熱點，如何將其應(yīng)用于發(fā)酵工程進行大規(guī)模生產(chǎn)目的產(chǎn)物將有待于繼續(xù)研究與關(guān)注。另外，無血清培養(yǎng)基目前還存在成本高的問題，因而降低其成本的方法值得探索。