一、儀器、試劑
    儀器：細(xì)胞培養(yǎng)瓶，移液槍?zhuān)瑯岊^盒（5ml、1ml、100μl、10μl），移液管（5ml、10ml），玻璃分裝瓶（100ml、200ml、500ml），高壓鋁盒（離心管、凍存管），離心機(jī)（800轉(zhuǎn)5min），倒置顯微鏡，細(xì)胞計(jì)數(shù)板，水浴箱（37℃）， CO₂培養(yǎng)箱（調(diào)整**37℃、5%CO₂）。
試劑：DMEM，Serum，Trypsin，P.S.，Puromycin，DMSO。
二、試劑配制
10ml Complete Media：DMEM 9ml；
                    Serum 1ml；
                    P.s. 100μl.
10ml Frozen Media：Complete Media 8ml；
                  Serum 1ml；
                  DMSO 1ml。
Puromycin(2μg/μl)：6μlPromycin/4ml CM
三、具體操作
1. 準(zhǔn)備：取各種已消毒的培養(yǎng)用品（槍頭盒、高壓鋁盒、分裝瓶）置于凈化臺(tái)面，紫外線(xiàn)消毒30分鐘，Media、Trypsin、Serum、P.S.、Puromycin從4℃冷藏拿出**室溫待用（使用之前用75%酒精全面消毒）。開(kāi)始工作前先洗手、戴上乳膠手套，用75%酒精噴拭手**肘部。
    紫外滅菌時(shí)間到后，將燈和風(fēng)機(jī)打開(kāi)，開(kāi)始工作。將Media、Trypsin、Serum、P.S.、Puromycin去除封口處密封條，用75%酒精噴拭全面消毒后拿進(jìn)去待用（注意：使用之前，應(yīng)充分搖勻）。合理擺放所需物品，盡量減少手部的大幅度擺動(dòng)，點(diǎn)燃酒精燈，配置100ml Complete Media：用10ml移液管吸取DMEM 10ml*9次**分裝瓶中，再吸取Serum 10ml**分裝瓶中，再加入1ml P.S.用移液管吹打混勻后待用。
2. 辛 將待處理細(xì)胞取出后，倒掉原有的培養(yǎng)基；
   安裝5ml移液槍頭后吸取PBS 5ml，每支細(xì)胞加入2.5ml，清洗細(xì)胞代謝物和培養(yǎng)瓶底部（清洗不干凈會(huì)使胰酶消化變難），清洗過(guò)后倒掉PBS（垂直傾斜瓶各倒一次，一定要倒干凈，防止殘余PBS稀釋Trypsin，影響酶解效果）。
   然后，每支細(xì)胞加入0.5ml Trypsin，搖擺培養(yǎng)瓶使其充分覆蓋瓶底，待每一支培養(yǎng)瓶都加入Trypsin搖勻后，再?gòu)?*支開(kāi)始，用力拍打培養(yǎng)瓶，左右搖擺使細(xì)胞都被消化下來(lái)，不在貼壁，依次拍打各支細(xì)胞，觀察，使其全部都消化完全（注意：控制消化時(shí)間不要太久，把握不好就要再顯微鏡下觀察）。然后再加入3倍體積的Media 1.5ml于培養(yǎng)瓶中，終止其消化。再確保槍頭無(wú)污染的前提下，同一種細(xì)胞可以用同一個(gè)槍頭來(lái)吹打細(xì)胞（仔細(xì)吹打培養(yǎng)瓶，尤其是邊邊角角），使其成為單細(xì)胞懸液。
3. 提前用鑷子準(zhǔn)備出4ml離心管，對(duì)應(yīng)每一支細(xì)胞，做好標(biāo)記。再細(xì)胞吹打完全后，用移液槍將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移**離心管中，用密封條封好口。待所有細(xì)胞都轉(zhuǎn)移**離心管后，①將待凍存的細(xì)胞放置于準(zhǔn)備好的碎冰中保存待用（合理放置防止染菌）；②將用于分瓶傳代的細(xì)胞先800轉(zhuǎn)離心5min（離心過(guò)程中，每一支培養(yǎng)瓶中加入3.5ml Media）后取出，去除封口膜，用酒精噴拭后（確保密封），打開(kāi)瓶蓋后燒瓶口滅菌，小心倒掉上清后燒瓶口滅菌，然后加入1ml或1.5ml Media吹打均勻（注意：不要產(chǎn)生大量氣泡）后，對(duì)應(yīng)各自的培養(yǎng)瓶，均勻的進(jìn)行一分二或一分三傳代，搖晃均勻，觀察后，放入CO₂培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。
4. 將①等待凍存的細(xì)胞懸液，進(jìn)行800轉(zhuǎn)離心5min。在此期間，配制凍存液ep:10ml，可在用完的serum15ml離心管中，加入8ml Media，1ml serum，1ml DMSO，吹打混勻后待用；然后用鑷子取出對(duì)應(yīng)的n支凍存管，做好標(biāo)記（名稱(chēng)、日期、作者姓名shou字母縮寫(xiě)）。
離心結(jié)束后，取出離心管，去除封口膜，用酒精噴拭后（確保密封），打開(kāi)瓶蓋后燒瓶口滅菌，小心倒掉上清后，燒瓶口滅菌，然后加入2ml配好的凍存液，吹打均勻后，進(jìn)行1分2的凍存，待所有細(xì)胞處理完全后，先**于-20℃中等待，然后轉(zhuǎn)移**-80℃冰箱中保存，并做好凍存記錄。
注意事項(xiàng):  
1、嚴(yán)格無(wú)菌操作，打開(kāi)/擰上瓶蓋時(shí)一定要燒瓶口滅菌。
2.凡是帶入超凈工作臺(tái)內(nèi)的酒精、PBS、培養(yǎng)基、胰蛋白酶的瓶子均要用75％酒精擦拭瓶子的外表面，并靠近酒精燈火焰操作。
3.器皿使用前必須過(guò)火滅菌。
4.繼續(xù)使用的器皿（如瓶蓋、滴管）要放在高處，使用時(shí)仍要過(guò)火。
5.各種操作要靠近酒精燈，動(dòng)作要輕、準(zhǔn)確，不能亂碰。如吸管不能碰到廢液缸。
6.吸取兩種以上的使用液時(shí)要注意更換吸管，防止交叉污染。
 
四、細(xì)胞的凍存（補(bǔ)充）
1.先將凍存管放入4℃冰箱，約40min。
2.接著置于-20℃冰箱，約30-60min。
3.置于-80超低溫冰箱（可保存半年）中放置過(guò)夜。
4.置于液氮罐中長(zhǎng)期保存。
5同時(shí)做好凍存記錄，在自己的筆記本和凍存記錄本上均要記錄。
6.不宜將凍存細(xì)胞放置在0℃～-60℃這一溫度范圍內(nèi)過(guò)久，低溫?fù)p傷主要發(fā)生在這一溫度區(qū)內(nèi)，是“危險(xiǎn)溫區(qū)”。
補(bǔ)充1：              細(xì)胞復(fù)蘇的原則
快速融化：必須將凍存在-196℃液氮中的細(xì)胞快速融化**37℃，使細(xì)胞外凍存時(shí)的冰晶迅速融化，避免冰晶緩慢融化時(shí)進(jìn)入細(xì)胞形成再結(jié)晶，對(duì)細(xì)胞造成損害。#p#分頁(yè)標(biāo)題#e##p#分頁(yè)標(biāo)題#e#
具體操作
一. 實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備：
1.將水浴鍋預(yù)熱**37℃。
2.大 紫外線(xiàn)照射30min的超凈工作臺(tái)臺(tái)面。
3.在超凈工作臺(tái)中按次序擺放好消過(guò)毒的離心管、槍頭盒、培養(yǎng)瓶等。
二．取出凍存管：
1.根據(jù)細(xì)胞凍存記錄按標(biāo)簽找到所需細(xì)胞的編號(hào)。
2.從液氮罐中取出細(xì)胞盒，取出所需的細(xì)胞，同時(shí)核對(duì)管外的編號(hào)。
三．迅速解凍：
1.迅速將凍存管投入到（注意：管口在液面以上避免染菌）已經(jīng)預(yù)熱的水浴鍋中迅速解凍，并要不斷的搖動(dòng)，使管中的液體迅速融化。
2.彪 約1-2min后凍存管內(nèi)液體完全溶解，再配平放入離心機(jī)中800r/min 離心5min后，取出后去除封口膜并用酒精噴拭凍存管的外壁和管口，用酒精燈燒瓶口后，小心吸棄凍存液，加入1ml Media，吹打制成細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液分裝入培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，加Media**4ml后，將培養(yǎng)瓶放入37℃和5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，換液的時(shí)間由細(xì)胞情況而定。

補(bǔ)充2：               細(xì)胞計(jì)數(shù) 
實(shí)驗(yàn)原理：當(dāng)待測(cè)細(xì)胞懸液中細(xì)胞均勻分布時(shí)，通過(guò)測(cè)定一定體積懸液中的細(xì)胞的數(shù)目，即可換算出每毫升細(xì)胞懸液中細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)目。
具體操作：
一.準(zhǔn)備工作：
取一瓶傳代的細(xì)胞，按照《傳代細(xì)胞培養(yǎng)（消化法）》中的傳代方法繁殖細(xì)胞，待長(zhǎng)成單層后以被使用。
二.細(xì)胞懸液制備：
細(xì)胞懸液的制備方法是用PBS液洗滌、0.25％的胰蛋白酶液消化后，加入培養(yǎng)液，吹打制成待測(cè)細(xì)胞懸液。
三.細(xì)胞計(jì)數(shù)：
1.蓋好蓋玻片：取一套血球計(jì)數(shù)板，將特制的蓋玻片蓋在血球計(jì)數(shù)槽上。
2.cc 制備計(jì)數(shù)用的細(xì)胞懸液：用吸管吸5滴細(xì)胞懸液到一離心管中，加入5滴臺(tái)盼藍(lán)染液（0.4％）或苯胺黑，活細(xì)胞不會(huì)被染色，加入染液后就可以在顯微鏡下區(qū)別活細(xì)胞和死細(xì)胞。
3.將細(xì)胞懸液滴入計(jì)數(shù)板：將待測(cè)細(xì)胞懸液吹均勻，然后吸取少量懸液沿蓋片邊緣緩緩滴入，要保證蓋片下充滿(mǎn)懸液，注意蓋片下不要有氣泡，也不能讓?xiě)乙毫魅肱赃叢壑小?br /> 4.統(tǒng)計(jì)四個(gè)大格的細(xì)胞數(shù)：將血球計(jì)數(shù)板放于顯微鏡的低倍鏡下觀察，并移動(dòng)計(jì)數(shù)板，當(dāng)看到鏡中出現(xiàn)計(jì)數(shù)方格后，數(shù)出四角的四個(gè)大格（每個(gè)大格含有16個(gè)中鉻）中沒(méi)有被染液染上色的細(xì)胞數(shù)目。
5.計(jì)算原細(xì)胞懸液的細(xì)胞數(shù):按照下面公式計(jì)算細(xì)胞密度：
（細(xì)胞懸液的細(xì)胞數(shù)）/ml＝（ 四個(gè)大格子細(xì)胞數(shù)/4) ×2×10⁴ 
說(shuō)明：公式中除以4因?yàn)橛?jì)數(shù)了4個(gè)大格的細(xì)胞數(shù)。
公式中乘以2因?yàn)榧?xì)胞懸液于染液是1：1稀釋。
公式中乘以10⁴因?yàn)橛?jì)數(shù)板中每一個(gè)大格的體積為：
1.0mm（長(zhǎng)）×1.0mm（寬）×0.1mm（高）＝0.1mm3 而 1ml＝1000mm3
四.細(xì)胞計(jì)數(shù)要點(diǎn)：
1.進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)時(shí)，要求懸液中細(xì)胞數(shù)目不低于104個(gè)/ml，如果細(xì)胞數(shù)目很少要進(jìn)行離心再懸浮于少量培養(yǎng)液中；
2.要求細(xì)胞懸液中的細(xì)胞分散良好，否則影響計(jì)數(shù)準(zhǔn)確性。
3.取樣計(jì)數(shù)前，應(yīng)充分混勻細(xì)胞懸液，尤其時(shí)多次取樣計(jì)數(shù)時(shí)更要注意每次取樣都要混勻，以求計(jì)數(shù)準(zhǔn)確；
4. 數(shù)細(xì)胞的原則是只數(shù)完整的細(xì)胞，若細(xì)胞聚集成團(tuán)時(shí)，只按照一個(gè)細(xì)胞計(jì)算。如果細(xì)胞壓在格線(xiàn)上時(shí)，則只計(jì)上線(xiàn)，不計(jì)下線(xiàn)，只計(jì)右線(xiàn)，不計(jì)左線(xiàn)。
5. 操作時(shí)，注意蓋片下不能有氣泡，也不能讓?xiě)乙毫魅肱赃叢壑校駝t要重新計(jì)數(shù)。
五.初學(xué)者易犯的錯(cuò)誤：
1. 計(jì)數(shù)前未將待測(cè)懸液吹打均勻。
2. 滴入細(xì)胞懸液時(shí)蓋玻片下出現(xiàn)氣泡。
3. 滴入懸液時(shí)的量太多，**使細(xì)胞懸液流入旁邊的槽中。