一、實驗目的
了解倒置顯微鏡的構造與使用，了解不同傳代細胞的形態及接毒后的病變特征，掌握細胞的傳代培養方法、病毒接種方法及收毒方法。
二、常用細胞的種類
BHK-21：倉鼠腎傳代細胞
PK-15：豬腎傳代細胞
IBRS-2：豬腎傳代細胞
Hela：人的子宮瘤細胞
Vero：非洲綠猴腎細胞
Marc-145：來源于Vero細胞
TK-143：人的胸苷激酶陰性細胞
Sf9：昆蟲細胞
三、材料
1、100ml細胞瓶、吸管、吸球、96孔細胞培養板、加樣器、槍頭
2、BHK-21（baby hamster kidney）細胞
3、0.25%胰酶
4、生長液：含10%犢牛血清、200U/ml青、鏈霉素的DMEM
維持液：含2-5%犢牛血清、200U/ml青、鏈霉素的DMEM
5、偽狂犬病病毒液（PRV）
四、傳代細胞培養的條件要求
1）細胞密度：2-3×10
5個/ml
2）pH范圍 **適pH7.0-7.4，耐受pH6.6-7.8
3）培養溫度
哺乳動物細胞一般為37℃
昆蟲細胞28-30℃
五、常用細胞分散劑與作用原理
1、胰酶 使精氨酸或賴氨酸的羧基和其他氨基酸的氨基之間的多肽鏈發生水解，導致細胞間質水解而使細胞或組織塊消化為分散的單個細胞。
2、乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）：與二價鈣、鎂離子結合，從而使細胞分散。
3、灰色鏈絲菌酶 ：由灰色鏈絲菌提取的一種酶制劑，是蛋白酶、氨肽酶和羧肽酶的混合物。
六、營養液
1、人工綜合營養液
氨基酸、糖類、無機鹽類、維生素、輔酶、嘌呤、嘧啶、輔助生長因子。
2、血清
1）血清的種類
胎牛血清、新生犢牛血清、成年牛血清、馬血清、雞血清、兔血清、羊血清、人血清，其中以新生犢牛血清使用**為廣泛。
2）血清的處理
無菌采集，過濾除菌。用前56℃滅活30min。
3）血清的作用
A、能提供細胞生存、生長和增生所必須的生長調節因子。
B、能補充基礎培養液中沒有或量不足的營養成分。
C、含有一些可供貼壁依賴型細胞在培養器皿表面貼附和鋪展的生長基質成分。
D、有中和毒性物質保護細胞不受傷害的作用。
E、給培養液提供良好的緩沖系統。
F、提供蛋白酶抑制劑，保護細胞免受細胞釋放的蛋白酶的損害。
4）應用血清存在的問題
A、血清中存在不少有害于細胞生長和繁殖的物質：補體、免疫球蛋白、生長抑制因子。
B、血清的成分不明確，影響對結果的分析。
C、不同動物、不同批次的血清成分和活性差別較大，使得培養結果不穩定。
七、傳代細胞系培養
1、優點：1) 可以無限的傳代。
2) 不少細胞系對病毒很敏感。
3) 某些傳代細胞系能在懸浮培養條件下培養，適合病毒抗原的大量生產。
4) 生長旺盛，繁殖快速，對營養條件不苛刻。
缺點：在傳代過程中遭到支原體和病毒的污染。
培養方法
1）取長滿單層的細胞一瓶，傾去培養液。
2）加入2ml 胰酶消化液，于37℃
培養箱放置幾分鐘，**細胞間出現空隙或細胞變圓后，倒去消化液。
3）加入生長液,反復吹打幾次，使細胞分散成單個細胞，然后分裝于3個小瓶中。再在每個小瓶中補充生長液**10ml，然后置37℃
培養箱培養，培養1-2天即可長成單層。
八、病毒（PRV）在傳代細胞中的培養
1、選長滿單層的細胞，倒掉培養液。
2、加入適量的病毒懸液
3、置溫箱中感作（吸附）45min-1h。
4、取出瓶子，倒掉或不倒掉培養液，補足維持液，置溫箱中繼續培養，直**80%以上的細胞病變。
5、收毒：將病變的細胞置于-20℃冰箱中，凍結后取出自然解凍，在解凍過程中振搖幾次，以使細胞完全從瓶壁上脫落。然后將病毒液收集于鹽水瓶或其它容器中。低溫貯藏備用。
實驗四 病毒感染力的滴定（TCID50的測定）
一、實驗目的
了解病毒感染力測定的幾種常用方法，掌握半數細胞培養物感染量TCID
50的操作步驟、計算方法及含義。
二、測定病毒感染力的方法
半數致死量LD
50( 50% lethal dose)：用動物或雞胚來檢測
半數雞胚感染量EID
50(egg 50% infective dose)：用雞胚來檢測
半數細胞培養物感染量TCID
50（50% tissue culture infective dose)：用細胞來檢測
蝕斑形成單位（plaque forming unit，PFU）：用細胞來檢測
三、材料
1、長滿單層的細胞1瓶
2、胰酶、吸球、吸管、生長液
3、96孔細胞培養板
4、加樣器、槍頭
5、病毒液（PRV）
四、TCID50的操作步驟
1、在青霉素瓶或離心管中將病毒液作連續10倍的稀釋，從10
-1-10
-10。
2、將稀釋好的病毒接種到96孔微量培養板中，每一稀釋度接種一縱排共8 孔，每孔接種100µl。
3、在每孔加入細胞懸液100µl，使細胞量達到2~3×10
5個/ml。
4、設正常細胞對照，正常細胞對照作兩縱排。（100µl生長液+100µl細胞懸液）#p#分頁標題#e##p#分頁標題#e#
5、逐日觀察并記錄結果，一般需要觀察5-7天。
6、結果的計算，按Reed-Muench兩氏法或Karber法
五、TCID50的計算方法
1、Reed-Muench兩氏法
|
病毒液稀釋度 |
出現CPE孔數 |
無CPE孔數 |
累 計 |
出現CPE孔所占的% |
|
CPE孔數 |
無CPE孔數 |
|
10-1 |
 8 |
 0 |
27 |
0 |
100（27/27） |
|
10-2 |
8 |
0 |
19 |
0 |
100（19/19） |
|
10-3 |
7 |
1 |
11 |
1 |
91.6 （11/12） |
|
10-4 |
3 |
5 |
4 |
6 |
40（4/10） |
|
10-5 |
1 |
7 |
1 |
13 |
0.7（1/14） |
|
10-6 |
0 |
8 |
0 |
21 |
0（0/21） |
CPE：Cytopathic effect
距離比例＝（高于50%病變率的百分數-50%）/（高于50%病變率的百分數-低于50%病變率的百分數）
＝（91.6-50）/（91.6-40）
＝ 0.8
lgTCID
50=距離比例×稀釋度對數之間的差+高于50%病變率的稀釋度的對數
=0.8×(-1)+(-3)
=-3.8
TCID
50=10
-3.8/0.1ml
含義：將該病毒稀釋10
3.8接種100µl可使50%的細胞發生病變。
2、Karber法
|
病毒液稀釋度 |
出現CPE的孔數 |
出現CPE孔的比率 |
|
10-1 |
8 |
8/8=1 |
|
10-2 |
8 |
8/8=1 |
|
10-3 |
7 |
7/8=0.875 |
|
10-4 |
3 |
3/8=0.375 |
|
10-5 |
1 |
1/8=0.125 |
|
10-6 |
0 |
0/8=0 |
lgTCID
50=L-d(s-0.5)
L：**高稀釋度的對數
D：稀釋度對數之間的差
S：陽性孔比率總和
lgTCID
50=-1-1×(3.375-0.5)
=-3.875
TCID
50=10
-3.875/0.1ml
含義：將該病毒稀釋10
3.875接種100µl可使50%的細胞發生病變。
Marc 145細胞培養和維持綜述
發布: 2010-02-10 來自: 易生物實驗 閱讀數：5241次
一、 細胞及培養
1、Marc145細胞
上皮樣細胞，來源于猴腎細胞，從母細胞（MA 104細胞）克隆而得到，可連續培養。
2、生長培養基
DMEM（高糖型，含4500mg/L D－葡萄糖、L-谷氨酰胺，和110mg/L丙酮酸鈉，不含碳酸氫鈉）＋5－10％新生牛血清+ 1%雙抗（青霉素和鏈霉素）的培養液。
3、凍存液
生長培養基＋10% DMSO
4、細胞健康生長的幾項注意事項
（1）細胞沒有支原體等外源因子的感染。
（2）培養液的pH值可在7.0－7.3，以7.2為佳。#p#分頁標題#e#
（3）一般按1：3傳代，細胞接種密度為1－1.5×105cells/ml，48hr后長成單層。#p#分頁標題#e#
（4）培養基和血清的質量可靠、穩定；建議采用特級小牛血清。
（5）細胞及時傳代，不可以在老化后傳代，一般在剛長成細胞單層時進行傳代、擴增。
（6）細胞傳代時消化液用0.25%胰蛋白酶+0.03%EDTA，消化過程應盡量縮短在1～2分鐘內完成。
二、 病毒感染、維持和收獲
轉瓶中細胞長成單層后，棄瓶內細胞生長液，接種PRRS病毒。37℃吸附1hr，加入維持液，置37℃恒溫室轉瓶機上旋轉培養3－5天。
維持液：DMEM+4～5％新生牛血清。
pH應為7.4～7.8；后期維持pH會慢慢降下來。
細胞病變時間出現在接毒后48小時，72～96小時細胞病變達80％左右，當細胞出現80%以上病變（CPE）時，即可開始收毒；反復傳過幾代后病變時間可縮短。
第3、4天注意觀察，細胞病變（CPE）達到80％時收獲病毒，－20℃凍融3次，混勻病毒懸液，96孔板測定TCID50。
收液時需要將含毒細胞反復凍融2～3次以破碎細胞，將病毒釋放到培養液中。
三、 細胞病變（CPE）
細胞在接種病毒后，24－48hr開始出現病變，72－96hr約達到80％病變。病變現象：細胞空泡化、圓縮、先灶狀脫落，再大片脫落，**后整個細胞裂解、破碎。圖1是指PRRSV感染后，出現細胞病變的Marc 145細胞。
四、 PRRS病毒在細胞中增殖規律（ Virology Journal, 2006, 3: 90）
PRRS病毒感染Marc 145細胞過程可大致分為兩個感染階段，**階段：病毒感染細胞后的20－22hr左右，僅部分細胞被隨機感染，而且Marc 145細胞對PRRS病毒的低感染性（low permissiveness）與MOI量無關，因為MOI劑量比常規量提高100倍，感染22hr后，仍僅5.5%的細胞呈PRRSV陽性（PRRSV-positive）。第二階段：感染后的2－3天（也稱為病毒的對數感染期），病毒感染蔓延是通過相鄰細胞和細胞之間的接觸感染，細胞對自由病毒不敏感（Cells is nonpermissive to free Virus），并出現了感染細胞群。 感染過程如圖5所示。
對我們的一點啟示：可以采用適當低量的MOI進行病毒感染，比如0.05virus/cell；同時，大部分細胞在維持期的**天尚需繼續生長，而且病毒在2－4天才是感染、增殖的高峰，較長的病毒維持期均需要供給豐富的營養物資，可以相信：維持液的營養成分對病毒增殖效率有非常重要的影響
細胞的復蘇
一、細胞復蘇的原則
在實際操作中，凍存細胞要進行復蘇，再培養傳代。復蘇細胞一般采用快速融化法。以保證細胞外結晶快速融化，以避免慢速融化水分滲入細胞內，再次形成胞內結晶損傷細胞。
二、細胞復蘇的主要操作步驟
(1)佩戴眼鏡和手套，從液氮罐中取出安瓿或冷凍管。
(2)迅速放入38℃水浴中，并不時搖動，在1分鐘內使其完全融化，然后在無菌下取出細胞。
(3)在1000r/min速度下離心5～10分鐘，棄去上層液，加入適量培養液后接種于培養瓶中，接種濃度1×109/L，置37℃溫箱靜置培養，次日更換一次培養液，繼續培養，觀察生長情況。若細胞密度較高，及時傳代。或無需離心直接將細胞加入瓶中，并加入培養基貼壁培養12～24小時后，充去上清，換入新鮮培養基繼續培養。
三、注意事項
在細胞復蘇操作時，應注意融化凍存細胞速度要快，可不時搖動安瓿或冷凍管，使之盡快通過**易受損的溫度段(-5～0℃)。這樣復蘇的凍存細胞存活率高，生長及形態良好。然而，由于凍存的細胞還受其他因素的影響，有時也會有部分細胞死亡。此時，可將不貼壁、飄浮在培養液上(已死亡)的細胞輕輕倒掉，再補以適量的新培養液，也會獲得較為滿意的結果。
